Práctica 10: Cariotipo. Siembra de sangre periférica.

1.OBJETIVO

Realizar un cultivo celular de sangre periférica para que los linfocitos T proliferen.

2.FUNDAMENTO

Un cultivo celular es el proceso mediante el que células pueden cultivarse en condiciones controladas. En esta ocasión vamos a cultivar una muestra de sangre humana para que los linfocitos T de la muestra proliferen y podamos realizarle el cariotipo. Para que las células se siembren, es preciso que tengan un medio de cultivo que las nutra: utilizaremos el medio de cultivo RPMI 1640. Además, también se tendrá que añadir en el cultivo fitohemaglutinina, la cual es una lectina que estimula la proliferación de linfocitos T y desdiferenciación a linfoblastos.

3.MATERIAL

• Micropipeta de rango de volúmenes 100 a 1000 microlitros.
• Gradilla.
• Tubo de hematología con heparina (verde).
• Medio de cultivo RPMI 1640.
• Fitohemaglutinina.

4.PROCEDIMIENTO

Lo primero que debemos de hacer es introducir el medio de cultivo RPMI 1640 -que se encontrará congelado- en el baño termostático.

 

 Mientras tanto, obtenemos la muestra de sangre, que será la nuestra propia y nos la extraerá un profesor del centro titulado en enfermería:

La muestra es de 1 ml y el tubo contiene heparina, un glicosaminoglicano muy sulfatado cuyo fin es no permitir la coagulación de la sangre (anticoagulante).

Deberemos llevar a cabo la técnica aséptica por lo que comenzaremos dejando activada la opción de rayos UV en la cabina de flujo laminar durante 10 minutos. Mientras tanto, prepararemos todo el material cerca de la cabina.

Cuando pasen los 10 minutos, rociaremos nuestras manos con guantes con alcohol y, seguidamente, todos los materiales que hemos preparado e iremos introduciendo los dentro y, una vez estén todos en su interior, volveremos a rociar nuestras manos. Ya no podremos sacar nuestras extremidades de la cabina.

 

Fijaremos el volumen de 250 microlitros y abriremos los tapones de la fitohemaglutinina y del medio de cultivo, dejándolos lejos del espacio de trabajo  siempre boca arriba. Colocamos una punta de micropipeta en la micropipeta y presionamos hasta el primer émbolo, lo dirigimos hasta el tubo de la fitohemaglutinina e introducimos la punta, donde soltaremos el émbolo.

Ahora conducimos la micropipeta hasta la alícuota que contiene el medio de cultivo y presionamos hasta el 2º tope.Desechamos la punta de la micropipeta y volvemos a renovarla con otra.

Volveremos a pipetear, siendo esta vez 400 microlitros de sangre completa de la muestra anterior y teniendo en cuenta que previamente deberemos mezclar la sangre para que todo contenga la misma cantidad de hematíes, glóbulos blancos, etc... . Los 400 microlitros serán vertidos a la anterior disolución de fitohemaglutinina y medio RPMI 1640.

6.CONDICIONES DE SEGURIDAD

Nunca se debe usar la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, hay que utilizar bata y guantes.

Si conectamos o desconectamos la cabina de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas.

Además es importante evitar la contaminación de los reactivos y la muestra de sangre así como de los tubos que las contendrán y el volumen que verteremos de ellos. Se evitará mediante una técnica aséptica. 

Cerraremos el espejo de cristal y la puerta de la estufa, evitando dejarlas abiertas el mínimo tiempo posible.

7.GESTIÓN DE RESIDUOS

La punta de micropipeta y el tubo que contenía la muestra se desecharán en el contenedor de residuos biológicos. El resto son desechados en un vaso de precipitado etiquetado como 'residuos', que irán a la papelera común.