Práctica 5: Mantenimiento del cultivo

1.OBJETIVO

Examinar las células bajo un microscopio. Buscar signos de células enfermas que podrían indicar que los medios celulares necesitan ser cambiados y las células necesitan ser subcultivadas. 
Renovación del medio de cultivo en dos día(Día 1 y día 2)

2.FUNDAMENTOS

Un cultivo celular es un modelo de estudio in vitro constituido por células que pueden crecer y mantenerse en suspensión o en monocapa por más de 24 horas en condiciones controladas. Existen dos categorías de cultivo celular: Cultivo Primario Línea Celular.
El cultivo celular de insectos es una opción habitual para la expresión de proteínas heterólogas. Crecen rápidamente y son fáciles de mantener. Las células se cultivan en atmósfera estándar y a temperatura ambiente.
Hay que observar y examinar la placa con un microscopio. Esta observación puede revelar la fuente de contaminación en el cultivo celular:

                     BACTERIAS         HONGOS            LEVADURAS

• BACTERIAS: los medios parecen nublados y pueden tener una película blanca en la superficie. Bajo el microscopio se verán células pequeñas y granulares, como puntos negros.

• HONGOS :  micelios filamentosos delgados que cubren el cultivo, como crecimiento borroso (típicamente blanco o negro) que es visible a simple vista.

• LEVADURAS: partículas redondas que son más pequeñas que las células de insectos. Normalmente se ve en cadenas de dos o más.

Usaremos el microscopio invertido cuya estructura está invertida en comparación al microscopio convencional. La fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional.

Además de la posible contaminación, también observaremos la salud de las células y la proporción de confluencia del cultivo celular. La confluencia se refiere al porcentaje de la superficie de una placa de cultivo que está cubierta por células adherentes.

3.MATERIAL

• Microscopio invertido.
• Cultivo celular en T-flask.
• Baño termostático
• Alícuota con penicilina (medio de cultivo)
• Gradilla
• Pipeta de 2 mL y 5 mL
• Auxiliar de pipeteo.

4.PROCEDIMIENTO

Antes que nada observaremos las células por primera vez en el microscopio invertido.

Vemos como hay células vivas , otras en apoptosis y hay síntomas de contaminación.
Comenzaremos sacando el tubo cónico Falcon de la nevera el cual contiene el medio de cultivo de penicilina y lo introduciremos dentro de un baño termostático y lo programamos a una temperatura de unos 37℃.

Una vez alcanzada la temperatura llevamos el tubo a la zona de trabajo, o sea a la cabina de flujo laminar, pero antes de introducirlo dentro hay que desinfectarlo por fuera con alcohol del 70%. Antes que nada, hay que realizar la práctica en condiciones asépticas al para trabajar con las células tal y como hablaba en la práctica número 3.

   Día 1 : Una vez hecho esto, introduciremos una pipeta desechable de 5 mL de manera vertical, un auxiliar de pipeteo(una pera), una gradilla y una vaso de precipitados para los residuos. En este día mi compañera introdujo 3 mL de medio contenido en el tubo T-Flask en el cultivo usando la parte TC de la pipeta de  5 mL enrasando correctamente. Hay que tener cuidado con los tapones hacia abajo para evitar la contaminación, y la presencia de pulseras....en las manos. Una vez hecho el trasvase de medio al cultivo, hay que etiquetar el tubo T-flask con el nombre del grupo.

   Día 2 : en este segundo día el procedimiento es el mismo excepto lo siguiente: en este caso usaré la pipeta de 2 mL y el auxiliar de pipeteo automático, y verteré este contenido en el cultivo celular para una posterior proliferación.

5.ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

La contaminación por levaduras y hongos está presente en el cultivo y las células se ven sanas y en apoptosis.

6.CONDICIONES DE SEGURIDAD

• Cerrar con cuidado el baño termostático y la estufa sin quemarnos.

• Usar el EPI adecuado

• No usar los rayos UV cuando se trabaja en la cabina de bioseguridad.

7.GESTIÓN DE RESIDUOS

Utilizamos un vaso de precipitado para los residuos y así depositar en el los plásticos y las pipetas ya usados.