Práctica 6: Recuento celular
1.OBJETIVO
Con esta práctica sabremos el número de células vivas y muertas de nuestro cultivo celular.2.FUNDAMENTO
Para hacer un seguimiento del cultivo celular, debemos saber la densidad celular en número de células/ml. Las células contadas deben estar vivas(viabilidad). Ambos procesos se realizan simultáneamente mediante los métodos de coloración con azul tripán (colorante que penetra en las células cuya membrana está rota) y recuento celular con un hemocitómetro llamado cámara de Neubauer la cual es un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensión superficial una vez vertida la muestra con el colorante en ella.
3.MATERIAL
- Gradilla
- Colorante azul tripán
- Tres tubos Eppendorf
- Micropipeta
- Puntas de micropipetas.
- Cultivo celular en tubos T-flask
- Alcohol 70%
- Vaso de precipitado para residuos
- Cámara de Neubauer desechable
- Microscopio
4.PROCEDIMIENTO
Antes que nada es imprescindible encender 30 min antes la cabina y activar el botón de rayos UV para esterilizarla al máximo y así evitar o disminuir contaminación al trabajar en ella .
A continuación, una vez finalizado el tiempo comenzamos con la introducción del material que vamos a usar desinfectandolo previamente usando la técnica de pulverización con alcohol del 70% . Es necesario el uso de guantes y las manos despejadas de pulseras , relojes o cualquier objeto que cuelgue. Una vez introducido todos los materiales debemos organizar la superficie de trabajo de tal forma que no nos moleste y para evitar posibles derrames, caídas, etc.
A continuación cogemos el T-flask y desenroscamos un poco para su posterior uso. Después introducimos la micropipeta con su correcta punta en el T-flask y extraemos 10μl del cultivo depositando este volumen en 4 tubos Eppendorf para los componentes del grupo. Una vez ya con el cultivo en los tubos Eppendorf, seguimos con la extracción de 10μl de azul tripán y añadimos este volumen al tubo Eppendorf mezclando ambos muy bien.
5.ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
No pudimos contar de forma fluida y rápida las células ya que hacía falta una disolución en el medio.
6.CONDICIONES DE SEGURIDAD
- Es importante no trabajar en la cabina con los rayos UV.
- También es importante conocer la composición de todo lo que se vaya a manejar , ya que alguien puede ser alérgic@ a una o varias sustancias.
- También es imprescindible el uso de un EPI adecuado, en este caso guantes y bata.
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